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点击次数:839 发布时间:2022/12/19 14:47:50
Western Blot(WB)实验代测
技术应用
通过抗原抗体反应对目标蛋白的表达进行半定量检测,还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。WB作为一种方便可靠的研究工具,将与谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。
为什么各个抗体都要进行 WB预实验?
对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗,与抗原更加有效的结合,从而获得特异性和非特异性背景之间差异的化。每一个抗体都有其特性,因此我们必须通过WB预实验获得背景小,非特异性条带少的实验结果。
预实验的内容如下:
1)确定一抗的稀释比例和孵育时间;
2)选择合适的封闭液及封闭时间;
3)调节合适的上样量,使内参条带灰度值趋于一致。
抗体使用有哪些注意事项?
使用抗体前需仔细阅读说明书,了解抗体的保存条件以及不同用途下的推荐稀释比例。较高浓度的抗体(>0.5mg/mL)通常性质更稳定,受生产工艺和成本控制等因素影响,不同品牌的抗体的浓度也不相同,所以购买时应注意比较,经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑,要注意相同质量下低浓度的抗体体积反而更大。
实验流程:
蛋白提取-制胶-电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-化学发光-结果分析;
送样运输要求:新鲜组织,100mg以上,干冰运输。细胞量为5*10^6以上,收集细胞沉淀,干冰运输。
Western Blot(WB)实验代测