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点击次数：4712 发布时间：2022/12/19 14:52:45
WB实验中应该如何使用内参？
✦ 简易标记法
只要在二抗孵育时加入 HRP 标记内参抗体，按照正常操作即可。
✦ Stripping 和 Reprobing
确定内参表达的常用方法是 Stripping 和 Reprobing。行目的蛋白的抗体孵育显色和检测。然后使用 Strip 缓冲液洗掉膜上的抗体，再用内参特异性抗体重新检测。
在 Strip 之后，为了确认完全的抗体去除，膜应洗涤、封闭，然后用二抗染色。如果 Strip 完成，二抗将不产生检测信号。如果检测到信号，则必须优化 Strip 条件。
✦ 剪膜实验
当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质 Marker 的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行检测。
WB实验中应该如何使用内参？
选择内参抗体需要考虑的因素
✦ 分子大小
内参蛋白分子大小（kDa）的选择非常重要，与目标蛋白相比，内参蛋白应该要足够大或足够小，以便与目标蛋白区分。如果目标蛋白和内参蛋白大小相当的话，WB 结果无法直接观察，很难进行准确数据的分析。
✦ 线性范围及上样量
线性范围是条带强度与膜上目标蛋白表达成比例的区域，过高或过低的上样量都会产生误差。很多情况下，目的蛋白的表达量相较于内参来说非常低，常常需要加大上样量，但是，这时内参表达量就会超出线性范围。超载的凝胶，在所有的泳道上表现出相同的条带强度，这种检测无疑是不准确的。
原创作者：上海信帆生物科技有限公司
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