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细胞膜与胞内蛋白提取试剂盒的使用方法

点击次数:504   发布时间:2022/12/7 14:17:44

细胞膜与胞内蛋白提取试剂盒的使用方法


 

本试剂盒能够从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮细胞中制备细胞 膜与胞内质膜组分。其试剂成分与优化的制备方案使胞膜制备过程简单易行,无需特殊设备和超速离心,可在1小时内完成。应用本试剂盒制备的胞膜是细胞 膜和细胞器膜如线粒体、内质网及质膜的混合物。制备得到的产物纯度可胜任后续的免疫沉淀、蛋白印迹、2-D gel、酶活性检测和受体分析等实验。

 

组成:(以下是50次规格用量)

CER  (Cytosol Extraction Reagent)       25ml    

MER (Membran Extraction Reagent)     2.5ml

Suspension Buffer                      10ml

 

储存:各组分4度 有效期12个月

 

操作步骤:

一.样本预处理:

收集细胞:(在每一次制备过程中,使用等量的细胞数将明显提高后续检测结果的一致性,因此建议在制备前对细胞准确计数)

1.      贴壁细胞:用PBS缓冲液冲洗细胞平皿,用胰蛋白酶消化细胞。800g离心5-10分钟,弃上清,用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。

2.      悬浮细胞:800g离心5-10分钟,弃上清。用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。

以下制备过程要在4 oC或冰水浴中进行

二.组织细胞匀浆裂解

1.      细胞匀浆裂解

向每1x107个细胞或每100µl(细胞离心后的体积)细胞沉淀中加入500µlCER试剂,震荡重悬,冰浴2分钟。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内,在冰水浴中上下手动匀浆20-30次。

注意:此破碎细胞步骤为关键环节。要使用1-3ml小容积玻璃匀浆器,须选用间隙严密的研杵,其特征是将研杵插入匀浆器套管后,可提起研杵而套管不会脱落。有效研磨是上下推拉而不是旋转。破碎效果与细胞类型有关,可在相差显微镜下检查,未裂解细胞应小于5%。

2.        组织块匀浆裂解:

取250mg哺乳动物新鲜或-80 oC冻存组织块放入冰预冷的玻璃匀浆器内,加入500µlCER试剂。用研杵捣碎组织块,上下手动匀浆20次,冰浴10分钟,然后上下手动匀浆7次。

注意:与培养细胞特别是贴壁细胞相比,组织块中的细胞在匀浆时较易破碎,因而并非必须选择间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密,会使组织匀浆困难,可选用研杵与套管稍松的匀浆器,破碎效果与组织细胞类型有关,可在相差显微镜下检查,未裂解细胞应少于5%。

三、粗提物制备:

取约500µl裂解物,转移到新的离心管中,800g ,4oC离心5分钟。上清为胞膜-胞浆混合物。

四、胞膜胞浆制备:

1)将步骤三获得的上清转移到新的离心管中,估计上清的体积; 2)加入上清液1/10体积的MER与上清液混合,冰浴5分钟;3)14,000rpm,4oC离心30分钟;4)沉淀为胞膜组分,含有细胞 膜和亚细胞器碎片,可短暂离心除尽液体,用50-100µl Suspension Buffer重悬备用或用RIPA裂解胞膜;做WB时膜蛋白分子量100KD以上的建议用较强的蛋白提取试剂如加强的RIPA,便于获取溶解度低的膜蛋白,具体方案根据试验目的确定。             

 

说明:

1.       Suspension Buffer不含去垢剂,重悬于Suspension Buffer中的胞膜或胞核组分呈不溶解状态是正常的,用户可用自备溶液重悬胞膜或胞核成分。如果进行蛋白印迹、2-D get等实验,用户可用SDS上样缓冲直接裂解细胞 膜或细胞核成分。对于进行免疫共沉淀实验来说,可用RIPA裂解液(C1053)重悬胞膜。

2.      试剂盒各组分中未添加蛋白酶抑制剂,可自行选择添加。

细胞膜与胞内蛋白提取试剂盒的使用方法

原创作者:上海信帆生物科技有限公司

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